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Bradford 蛋白定量实验方案（中文翻译）

原文标题：Bradford Assay with Pierce™ Bradford Protein Assay Kit

说明：以下内容为对原始实验文档的忠实中文翻译，并在每一步后补充“本步目的”，便于理解实验设计。凡原文未给出的数值或条件，均不擅自补充。

一、标准液

由白蛋白（BSA）储备液配制以下标准液，用于 100–1500 µg/mL 的工作范围。

原文表题：Dilution scheme for standard test tube and microplate protocols (working range = 100–1500 µg/mL)

管号稀释液体积BSA 体积及来源最终 BSA 浓度
A0300 µL 储备液2000 µg/mL
B125 µL375 µL 储备液1500 µg/mL
C325 µL325 µL 储备液1000 µg/mL
D175 µL175 µL B 管稀释液750 µg/mL
E325 µL325 µL C 管稀释液500 µg/mL
F325 µL325 µL E 管稀释液250 µg/mL
G325 µL325 µL F 管稀释液125 µg/mL
H400 µL100 µL G 管稀释液25 µg/mL
I400 µL00 µg/mL（空白）

由上述标准储备液进一步配制 1:5 稀释液 作为工作液（例如：取 10 µL 标准储备液，加 40 µL dH2O）。

本步目的：制备一系列已知浓度的蛋白标准品，以建立标准曲线，从而推算未知样品的蛋白浓度；其中空白管用于背景扣除。

二、96 孔板实验流程

  1. 在通风橱内操作，并佩戴手套。
    本步目的：保证实验安全，减少与试剂直接接触的风险，同时降低样品污染概率。
  2. 将 Coomassie Bradford Protein Assay Reagent（4°C 冰箱保存）用 dH2O 按 1:5 稀释。 例如：3 mL Coomassie Bradford Protein Assay Reagent 加 12 mL dH2O；每个样品需要 250 µL 稀释后的试剂。
    本步目的：将显色试剂稀释到适用于 96 孔板检测的工作浓度，并估算每孔所需体积，以便提前准备足量试剂。
  3. 取所需体积的 Coomassie Bradford Protein Assay Reagent，先恢复至室温，再加入 dH2O，轻轻混匀。
    本步目的：使试剂温度稳定，减少温度差导致的显色偏差，并通过轻柔混匀保证试剂均一。
  4. 向对应孔中加入 5 µL 各标准品或未知蛋白样品，然后向每孔加入 250 µL 稀释后的 Coomassie Bradford Protein Assay Reagent。
    本步目的：使蛋白与 Bradford 染料结合并发生显色反应；标准品用于建曲线，未知样品用于浓度测定。
  5. 轻柔吹打混匀。
    本步目的：确保样品与试剂充分接触，使各孔反应一致，提高重复性。
  6. 室温孵育 10 分钟。
    本步目的：给予染料与蛋白充分结合和颜色稳定的时间，从而获得可靠吸光度读数。
  7. 使用酶标仪在 595 nm 测定吸光度（2 楼设备）。
    本步目的：595 nm 是 Bradford 法常用检测波长，用于定量分析蛋白-染料复合物形成后的吸光信号。
  8. 分光光度计信息：Molecular Devices, Spectra max PLUS；需通过 ClusterMarket 预约。
    本步目的：明确仪器型号和预约方式，保证实验当天可顺利完成检测。
  9. 选择在吸光度测定前带振荡（shaking）的测定方法。
    本步目的：在读数前进一步均匀孔内液体，减少沉降、分层或加样不均对结果的影响。
  10. 用空白孔在 595 nm 的平均吸光度，对所有其他标准品或未知蛋白样品的吸光度进行扣除。
    本步目的：去除背景信号与试剂本底影响，使结果更准确地反映蛋白本身引起的显色强度。
  11. 以每个 BSA 标准品经空白校正后的 595 nm 平均吸光度对其浓度（µg/mL）作图，建立标准曲线；据此确定各样品的蛋白浓度。
    本步目的：通过已知标准与吸光度之间的关系，将未知样品的吸光值换算为实际蛋白浓度。

三、96 孔板布局（按原文整理）

123456789101112
AABCDEFGH
BABCDEFGH
CABCDEFGH
D
E
F
G
H

注：上表按原文表格直接转写。A–H 很可能对应不同标准品/样品组，A–C 行可能为重复孔，但原文未进一步解释。