Marchantia CRISPR/Cas9 克隆流程（中文翻译）

一、gRNA 寡核苷酸示例

二、Marchantia 中 CRISPR/Cas9 系统克隆流程

原文说明：according to Sugano et al., 2018 [PLOS One]

1. 寡核苷酸的磷酸化与退火

• 1 µL oligo 1（100 µM 储存液）
• 1 µL oligo 2（100 µM 储存液）
• 1 µL 10× T4 ligation buffer（必须含 ATP，例如 NEB）
• 6.5 µL dH₂O
• 0.5 µL T4 polynucleotide kinase

退火程序：

• 37 °C 30 min
• 95 °C 5 min
• 以 5 °C/min 速率降温至 25 °C

2. 用 BsaI 酶切 pMpGE_En03

• 1 µg DNA
• 5 µL 10× CutSmart buffer
• 1 µL BsaI restriction enzyme（NEB）
• 以 dH₂O 补足至 50 µL

37 °C 孵育 3 h；随后按照 PCR clean-up kit 说明纯化线性化载体，但用 15–20 µL dH₂O 洗脱。

3. 线性化载体与退火寡核苷酸连接

• 1 µL 退火并磷酸化后的寡核苷酸双链（1:200 稀释）
• 2 µL 10× ligation buffer（含 ATP）
• 50 ng 线性化且已纯化的载体
• 以 dH₂O 补足至 20 µL 小计体积
• 最后加入 1 µL T4 ligase

室温孵育 1–2 h，随后冰箱过夜。之后转化至感受态细菌，使用卡那霉素筛选。

4. 第一轮菌落 PCR 鉴定

• 使用 oligo-F primer 和 M13-R primer
• 阳性转化子应出现约 250 bp 条带
• 选阳性克隆做过夜培养

5. LR 反应（采用厂家建议体积的一半）

• 75 ng pMpGE_En03_oligos
• 150 ng pMpGE010 或 pMpGE011（若有问题可调比例）
• 至少 2 µL TE buffer pH 8.0（10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA）
• 以 dH₂O 补足至 4 µL
• 加入 0.5 µL LR clonase

轻弹混匀两次，短暂离心，室温至少孵育 1 h（更推荐 2–4 h 或过夜），然后转化入感受态细菌，使用壮观霉素筛选。

6. 第二轮菌落 PCR 鉴定

• 仍使用 oligo-F primer 和 M13-R primer
• 阳性转化子应出现约 500 bp 条带
• 若使用自制感受态，可能出现大小不一的菌落，优先挑选大菌落
• 可能出现 250 bp、250+500 bp 或仅 500 bp 条带；只保留目标正确者

三、快速基因组 DNA 提取（原文附带）

• Extraction solution E7526-24 mL（Sigma-Aldrich）
• Dilution solution D5688-12 mL（Sigma-Aldrich）

1. 向 PCR 管中加入 15–30 µL extraction buffer。
2. 加入一小块植物组织；样品之间注意无菌操作，组织应完全浸没在液体中。
3. 在 PCR 仪中 90 °C 孵育 10 min。
4. 加入等体积 dilution buffer（与 extraction buffer 体积比 1:1）。
5. 吹打混匀，gDNA 即可使用；可冷藏或 -20 °C 保存。
6. 若 PCR 反应总体积为 50 µL，则取 4 µL 混合物使用。

四、说明